El fenómeno de la Reflexión Interna Total (TIR) se puede observar en la vida cotidiana. Por ejemplo en el tallado de una piedra preciosa. Manteniendo la luz en el interior de un diamante y creando tantas reflexiones como sea posible, la luz produce antes de salir el llamado “fuego” de una piedra preciso. La luz realiza múltiples reflexiones internas antes de ser refractada. El mismo principio se usa en los sistemas modernos de transmisión de datos por fibra óptica.
El objetivo de usar Fluorescencia de Reflexión Interna Total (TIRF) en aplicaciones biológicas es estudiar fenómenos que se producen en la unión de dos medios diferentes. Un simple ejemplo podría ser una gota de agua en una placa de vidrio.
¿Qué ocurre en la unión agua/vidrio si el haz incidente la alcanza por encima del ángulo crítico (definido por la densidad de la unión de los dos medios)?
El término Reflexión Interna Total (TIR) no es del todo correcto en este caso. No obstante, la expresión “Reflexión Total Atenuada” (ATR) describe este fenómeno un poco mejor. Mirando a esta unión (interfase) y especialmente al medio con menor índice de refracción (agua), se forma una onda evanescente donde la intensidad decrece exponencialmente con la distancia. En otras palabras, parte de la onda (intensidad) penetra en el medio circundante. La profundidad de la penetración depende del ángulo, de la longitud de onda y del índice de refracción de los dos medios implicados. Volviendo al ejemplo citado arriba, la profundidad de penetración ligeramente por encima del ángulo crítico (60º) equivale, aproximadamente, a 1,5 veces la longitud de onda usada.
¿Cómo se realiza el TIRF, desde un punto de vista técnico, en los sistemas de TILL Photonics?
Cambiando el ejemplo descrito arriba por uno más biológico -el uso de una célula circundada por un medio en vez de una gota de agua y un cubreobjeto en vez de simple vidrio- muestra la posibilidad de investigar aplicaciones biológicas.
Como se ha mostrado en la sección previa, uno tiene que controlar el ángulo de la luz incidente. En el caso de TILL, usamos un láser como fuente de excitación. El láser se enfoca en el fondo del plano focal del objetivo. Asumiendo que el láser está enfocado en el centro del fondo del plano focal, la luz sale del objetivo a lo largo del eje óptico del sistema. Moviendo el foco fuera del centro hacia la cara del fondo del plano focal la luz sale del objetivo bajo cierto ángulo. Cuanto más alejemos el foco del centro, mayor será el ángulo que la luz alcanza al salir. Para poder alcanzar el ángulo crítico necesario para la reflexión interna total, necesitamos al menos un objetivo con una AN de > 1,39 para la interfase vidrio/agua. Usando un objetivo estándar de 1,4 AN es casi imposible ajustar un sistema TIRF. Por lo tanto se han de desarrollar objetivos que una apertura numérica extremadamente alta. El objetivo habitual para TIRF tiene un AN de 1,45. El objetivo con mayor apertura comercialmente disponible es de 1,65, fabricado por Olympus. La apertura numérica del objetivo limita el ángulo que se puede alcanzar con la luz de excitación, y por lo tanto limita también la profundidad de penetración mínima.
Aplicaciones
– Seguimiento de gránulos secretores en células intactas
– Visualización selectiva de regiones de contacto célula/sustrato
– Translocalización de proteínas
– Detección selectiva de membranas de proteínas, como por ejemplo canales iónicos
– Visualización de moléculas cerca de la superficie
– Medida de fuerzas en contactos moleculares simples
– Observación de fluorescencia en células vivas a largo plazo
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